Proses
Sterilisasi Kultur Jaringan
Kultur
jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti
protoplasma, sekelompok sel, jaringan dan organ, serta menumbuhkannya dalam
kondisi aseptic sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan
beregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali. Bertolak dalam definisi tersebut,
maka keberhsilan dalam kultur jaringan di tentukan oleh; keterampilan pekerja,
sterilitas media yang di gunakan, kondisi ruang kerja (ruang transfer) yang di
gunakan serta kondisi peralatan yang di pakai.
Sterilisasi
Bagian yang sangat penting dalam teknik in vitro adalah sterilisasi bahan
tanaman dan media dan menjaga kondisi aseptik yang telah dicapai. Bakteri dan
jamur adalah dua kontaminan yang paling banyak dijumpai dalam kultur. Spora
jamur sangat ringan dan ada disekeliling lingkungan. Apabila spora jamur kontak
dengan media kultur dan kondisinya optimal untuk perkecambahan jamur, maka akan
terjadi kontaminasi.
I.
Sterilisasi Ruang Keja
Ruang (ruang
transfer/penabur) dalam teknologi kultur jaringan mutlak harus dalam kondsi
steril, tanpa kondisi demikian tingkat keberhasilan dalam kultur jaringan akan
rendah. Sterilisasi ruang dapat dilakukan dengan menyemprot ruangan dengan
alkohol 70% sedangkan sterilisasi lantai di lakukan dengan alkohol atau dengan
larutan desifektan lainnya. (BKPM Kultur jaringan dasar edisi-2)
Sterilisasi ditujukan
agar terjadi denaturasi protein dan terutama tidak aktifnya enzim yang
digunakan untuk metabolisme bakteri,dan perlakuan panas ditujukan untuk membunuh
spora bakterinya. Sterlisasi pada medium dan alat-alat bertujuan untuk mencegah
adanya bakteri yang tidak diinginkan dalam pemiaraan (Waluyo, 2008).
a.
Lingkungan Umum
Sterilisasi ruang trasfer secara
keseluruhan
·
Ruang persiapan (alat-alat, hot plate,
alas kaki)
·
Ruang bahan media tanam (lemari,
botol)
·
Ruang tanam (laminar, meja)
·
Ruang kultur (rak kultur)
b.
Lingkungan Khusus
Menjaga kebersihan ruang tanam
Langkah-langkah:
·
Nyalakan laminar
·
Ruang pada laminar disemprot alkohol
70%, lalu usap dengan tisu
·
Lampu UV dinyalakan selama kurang
lebih satu jam
·
Alat-alat dan bahan disemprotkan
alkohol 70% sebelum dimasukan laminar
Sterilisasi ruang
kultur yang paling baik adalah dilakukan dengan penggunaan sinar ultraviolet
(UV). Waktu sterilisasi bervariasi tergantung dari ukuran ruang transfer itu
sendiri dan harus dilakukan apabila tidak ada kegiatan dalam ruang tersebut.
Radiasi UV sangat berbahaya bagi mata dan kulit. Ruang transfer dapat juga
disterilisasi dengan mencuci/mengepel 1-2 kali setiap bulan dengan bahan anti
jamur (fungisida) komersial.
II.
Sterilisasi Peralatan Gelas dan
Peralatan Lain.
Peralatan yang terbuat
dari metal, gelas, aluminium foil, dll., dapat disterilsasi dengan cara pengeringan
dalam oven pada suhu 170oC selama 1 jam. Semua peralatan tersebut
harus dibungkus sebelum di oven, tetapi jangan menggunakan kertas karena akan
akan terdekomposisi pada suhu 170oC.
Sterilisasi dengan
menggunakan autoclave tidak dsarankan untuk bahan yang terbuat dari metal
karena akan menyebabkan karat. Untuk peralatan diseksi yang akan digunakan pada
ruang transfer atau laminar, setelah disterilisasi dalam oven harus direndam
dahulu dalam alkohol 96% kemudian dibakar di atas lampu bunsen.
Teknik ini disebut
sterilisasi pembakaran (flame sterilization). Teknik ini harus dilakukan dengan
ekstra hati-hati karena alkohol sangat mudah terbakar. Autoclave adalah metoda
sterilisasi dengan menggunakan tekanan uap air. Bahan-bahan atau alat yang
dapat disterilisasi dengan cara autoclave ini antara lain kapas penutup tabung,
saringan dari nylon, pakaian lab, tutup plastik, peralatan gelas, pipet, air,
dan media kultur. Hampir semua mikroba dapat mati bila diautoclave pada suhu
121oC dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit.
III.
Sterilisasi Media
Ada dua metoda untuk
sterilisasi media yang umum digunakan, yaitu dengan autoclave dan filter
membran. Media kultur, air destilasi dan campuran yang stabil dapat
disterilisasi dalam autoclave dengan menggunakan wadah yang ditutup dengan
kapas, aluminium foil atau plastik. Akan tetapi, larutan dari bahan-bahan yang
bersifat tidak stabil (heat-labile) harus menggunakan filter. Umumnya media
diautoclave pada tekanan 15 psi dengan suhu 121oC. Untuk volume
larutan per wadah yang sedikit (< 100 ml), waktu yang dibutuhkan adalah
15-20 menit, tetapi untuk jumlah yang besar (2-4 liter) selama 30-40 menit.
Tekanan jangan melebhi dari 20 psi karena dapat mengakibatkan dekomposisi
karbohidrat dan bahan lain dalam media yang bersifat thermolabile.
Beberapa senyawa yang
tergolong dalam kelompok protein, vitamin, asam amino, ekstrak tanama, hormon
dan karbohidrat ada yang bersifat thermolabile yang mungkin akan mengakibatkan
dekomposisi bila disterilisasi dengan autoclave, sehingga harus disterilisasi
dengan filter. Filter Millipore yang mempunyai porositas ± 0.2 mikron (µm)
merupakan salah satu filter yang banyak digunakan untuk sterilisasi bahan yang
bersifat thermolabile. Peralatan gelas yang akan menampung media yang
disterilisasi dengan filter harus sudah disterilisasi dahulu dengan autoclave.
Media yang sebagian
mengandung komponen thermolabile, dapat dibuat dengan cara: (i) larutan yang
mengandung komponen heat-stable disterilisasi dengan autoclave, kemudian
didinginkan sampai suhu 50o-60oC pada kondisi steril (biasanya dalam laminar),
(ii) pada bagian lain dalam kondisi yang steril, larutan yang mengandung
komponen besifat thermolabile disterilisasi dengan filter, (iii) kedua larutan
yang sudah disterilisasi dengan metoda yang berbeda tersebut digabungkan dalam
kondisi aseptik.
IV.
Sterilisasi Bahan Tanaman
Mendapatkan bahan
tanaman yang steril merupakan hal yang sulit. Meskipun bermacam tindakan
pencegahan sudah dilakukan, 95% kultur akan mengalami kontaminasi apabila
eksplan tidak didisinfeksi. Organ atau jaringan tanaman harus disterilisasi
dengan larutan disinfektan, karena sebagai bahan biologis tidak dapat dilakukan
dengan cara pemanasan yang ekstrim.
Tidak ada metoda yang
baku untuk sterilisasi eksplan, sehingga waktu perendaman dalam larutan
disinfektan merupakan kisaran karena tergantung pada jenis bahan dan tanaman
yang akan disterilisasi. Larutan yang digunakan harus yang aman bagi
jaringan/eksplan tetapi bersifat dapat membunuh kontaminan baik bakteri maupun
jamur. Untuk tanaman berkayu, umbi dll. biasanya sebelum disterilisasi dengan
larutan disinfektan harus dibersihkan dahulu dengan sabun dan dibilas dengan
air mengalir, tetapi tidak untuk tanaman jenis herbaceous. Semua permukaan
eksplan yang disteriliasi harus terendam dalam sterilan, dan setelahnya harus
dibilas dengan akuades steril sekurang-kurangnya tiga kali.
Hal-hal yang
menentukan keberhasilan sterilisasi eksplan:
·
Bagian tanaman
·
Tempat pengambilan eksplan
·
Umur eksplan
·
Ukuran eksplan
·
Umumnya yang masih tumbuh aktif:
-
Sel-sel masih aktif membelah diri
-
Lebih bersih
·
Biji (embrio atau kotiledon), tunas,
pucuk, potongan batang, satu buku, potongan akar, potongan daun, potongan umbi
batang, umbi lapis dengan sebagian batang dan bagian bunga
·
Umur eksplan/umur tanaman induk
·
Eksplan ukuran besar beresiko terkena kontaminasi
tinggi dibanding eksplan ukuran kecil
Prosedur sterilisasi
eksplan:
1.
Eksplan dicuci menggunakan deterjen
dengan air mengalir, lalu potong dengan ukuran 2 cm
2.
Untuk tanaman berkayu dicelupkan ke
dalam alkohol 70% selama beberapa detik
Sterilisasi
eksplan benih:
·
Biji dicuci menggunakan aquades
·
Biji direndam selama 60 menit
menggunakan air panas yang dicampur diterjen
·
Benih dibilas kembali
·
Benih ditanam di media
·
Steril di laminar:
Benih dibilas dua kali dalam aquades
selama 5 menit/bilasan
Di
dalam memulai melakukan kegiatan kultur jaringan diperlukan ruang dan
peralatan. Ukuran ruang yang diperlukan dapat disesuaikan dengan volume
aktivitas kultur jaringan yang akan dilakukan. Ruang yang diperlukan untuk
kegiatan kultur jaringan yaitu laboratorium yang ideal yang memiliki:
1)
Ruang persiapan yang di dalamnya
terdapat timbangan analitik, lemari pendingin, hotplate, mikrowave, oven, pH
meter, alat-alat gelas standar (labu takar, pipet volume, erlenmeyer, gelas
piala, batang pengaduk dari gelas, dan wadah kultur), alat untuk mencuci
(washtaple), lemari untuk alat dan bahan kimia, sentrifuse, fumehood,
destilator, dan kereta dorong;
2)
Ruang transfer yang di dalamnya
terdapat laminar air flow, dissecting, mikroskop, alat diseksi, lemari tempat
penyimpanan alat-alat steril, dan timbangan kecil.
3)
Ruang kultur yang dilengkapi dengan
rak kultur dan lampu fluorescent, timer untuk mengatur lama penyinaran, AC
untuk mengontrol temperatur, mikroskop binokuler, dan shaker (Barahima, 2011).
Peralatan
yang mutlak dimiliki untuk memulai melakukan kegiatan kultur jaringan yaitu:
timbangan analitik, destilator, pH meter, autoclaf, laminar air flow, dan
gelas-gelas standar. Peralatan ini kemungkinan dapat menimbulkan resiko pada
pemakainya atau menimbulkan kerusakan apabila salah prosedur dalam
mengoperasikannya (Barahima, 2011).
Medium
yang digunakan untuk kultur jaringan tanaman dapat berupa medium padat atau cair. Medium padat
digunakan untuk menghasilkan kalus yang selanjutkan diinduksi membentuk tanaman
yang lengkap, sedangkan medium cair biasanya dugunakan untuk kultur sel. Medium
yang diggunakan mengandung lima komponen utama, yaitu senyawa anorganik, sumber
karbon, vitamin, zat pengatur tumbuh dan suuplemen organik (Adnan, 2011).
Sterilisasi
adalah istilah mutlak yang artinya mematikan semua bentuk kehidupan pada suatu
daerah. Sehingga dalam sterilisai nanti alat-alat tidak terkontaminasi dengan
pihak luar. Sterilisasi terbagi menjadi dua, yaitu:
1)
Sterilisasi basah ,yaitu sterilisasi
yang menggunakan autoklaf dengan temperatur 121˚C tekanan 1 atm/0,15 Mpa selama
15-20 menit.
2)
Sterilisasi kering, yaitu sterilisasi
yang menggunakan oven dengan temperatur 160-170˚C. Selama kurang lebih 2 jam.
Sumber:
http://anaktptph-agriculture.blogspot.com/2014/10/sterilisasi-alat-dan-ruang-laboratorium.html
Materi Perkuliahan Mata Kuliah KulturJjaringan
Komentar
Posting Komentar