Kultur Jaringan Tanaman (Part 2)

Media Kultur Jaringan

Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya.

Media yang digunakan biasanya berupa garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu diperlukan juga bahan tambahan seperti agar-agar, gula, arang aktif, bahan organik dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenis maupun jumlahnya.

Komponen Media Kultur Jaringan

Ø  Media Kultur In Vitro

Medium kultur jaringan atau kultur in vitro dapat berupa medium padat atau cair.

Medium ini terdiri atas :

·         Garam-garam anorganik berupa unsur hara makro maupun mikro

·         Zat organik seperti vitamin, karbohidrat (gula), zat pengatur tumbuh, myo-inositol, dan asam-asam amino

·         Agar (untuk media padat)

Ø  Garam-Garam Anorganik

Keperluan garam anorganik dalam jaringan hampir sama dengan tanaman utuh. Setiap Tanaman memerlukan paling sedikt 16 unsur untuk pertumbuhan yang normal, terdiri dari unsur esensiel makro dan mikr. Konsentrasi optimal dari tiap komponen untuk mencapai kecepatan pertumbuhan yang maksimal sangat bervariasi.

Ø  Unsur Makro

Unsur makro dibutuhkan dalam jumlah yang cukup besar, terdiri dari : C, H, O, N, S, P, K, Ca dan Mg. Unsur C, H dan O terdapat di udara, unsur N,P dan K merupakan unsur yang mutlak harus tersedia, sedangkan unsur S, Ca dan Mg boleh ada atau tidak, tetapi karena fungsinya sangat mendukung pertumbuhan jaringan, maka akan lebih baik apabila unsur-unsur tersebut juga tersedia.Unsur makro biasanya diberikan pada media dalam bentuk persenyawaan.

1)    Nitrogen (N)

Diberikan dalam bentuk NH4NO3, NH2PO4,NH2SO4.Berfungsi untuk membentuk protein, lemak, dan berbagai senyawa organik lain, morfogenesis (pertumbuhan akar dan tunas), pertumbuhan dan pembentukan embrio, pembentukan embrio zigotik dan pertumbuhan vegetatif.

2)    Fosfor (P)

Diberikan dalam bentuk KH2PO4.Berfungsi untuk metabolisme energi, sebagai stabilitor membran sel, pengaturan metabolisme tanaman, pengaturan produksi pati/amilum, pembentukan karbohidrat, sangat penting dalam transfer energi, protein, dan sintesis asam amino serta konstribusi terhadap struktur dan asam nukleat.

3)    Kalium (K)

Diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2O.Berfungsi untuk pemanjangan sel tanaman, memperkuat tubuh tanaman, memperlancar metabolisme dan penyerapan makanan, ion kalsium ditransfer secara cepat menyebrangi membran sel dan mengatur pH dan tekanan osmotik di antara se

4)    Kalsium (Ca)

Diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2O.Berfungsi untuk merangsang bulu-bulu akar, penggandaan atau perbanyakan sel dan akar, pembentukan tabung polen, dinding dan membran sel lebih kuat, tahan terhadap serangan patogen, mengeraskan batang, memproduksi cadangan makanan.

5)    Sulfur (S)

Unsur S merupakan unsur yang penting untuk pembentukan beberapa jenis protein, seperti asam amino dan vitamin B1. Unsur S juga berperan penting dalam pembentukan bitil-bintil akar.

6)    Magnesium (Mg)

Diberikan dalam bentuk MgSO4.7H2O.Berfungsi untuk meningkatkan kandungan fosfat, pembentukan protein.

7)    Besi (Fe)

Diberikan dalam bentuk Fe2(SO4)3;FeSO4.7H2O.Berfungsi sebagai penyangga (chelatin agent) yang sangat penting untuk menyangga kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman.Pada tanaman, Fe berfungsi untuk pernapasan dan pembentukan hijau daun.

Ø  Unsur Mikro

Adalah hara yang dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit. Unsur hara mikro ini merupakan komponen sel tanaman yang penting dalam proses metabolisme dan proses fisioligi lainnya (Gunawan, 1992). Unsur hara mikro tersebut diantaranya adalah :

a.   Klor (Cl), diberikan dalam bentu KI.

b.   Mangan (Mn), diberikan dalam bentuk MnSO4.4H2O.

c.    Tembaga (Cu), diberikan dalam bentuk CuSO4.5H2O.

d.   Kobal (CO), diberikan dalam bentuk CoCl2.6H2O.

e.   Molibdenun (Mo), diberikan dalam bentuk NaMoO4.2H2O.

f.     Seng (Zn), diberikan dalam bentuk ZnSO4.4H2O.

g.    Boron (B), diberikan dalam bentuk H3BO3.

Ø  Vitamin

Pada beberapa media kultur juga sering ditambahkan vitamin-vitamin seperti biotin, asam folat, asam askorbat, asam panthotenat, vitamin E (tokoperol), riboflavin, dan asam p-aminobenzoik. Meskipun vitamin-vitamin tersebut bukan merupakan faktor pembatas pertumbuhan, tetapi sering memberikan keberhasilan dalam kultur sel dan jaringan tanaman. Biasanya penambahan vitamin-vitamin tersebut ke dalam media dilakukan apabila konsentrasi thiamin dianggap dibawah taraf yang diinginkan atau apabila jumlah populasi sel-sel yang tumbuh masih rendah.

Ø  Zat-Zat Organik

1.    Karbohidrat (gula) : sbg sumber energi utk induksi kalus dan pertumbuhan kalus.

2.    Myo-inositol : membantu diferensiasi dan pertumbuhan jaringan

3.    Vitamin : mempercepat p’tumbuhan & diferensiasi kalus. Yg sering dipakai : Thiamin-HCl, Nicotinic acid, Biotin, Pyridoxin-HCl, Folic-acid, Adenin, Riboflavin.

4.    Thiamin : mempercepat pembelahan sel pada meristem akar

5.    Ascorbic acid : mencegah browning (pencoklatan pd permukaan irisan jaringan krn reaksi oksidasi senyawa polyphenol menjadi quinon yg berwarna coklat)

6.    Asam amino : merupakan sumber N organik yg lebih cepat dapat diserap drpd N anorg di dalam medium yang sama

7.    Yang sering dipakai : L-arginin, L-aspartic acid, L-cystein, L-glutamine, L-asparagin, L-methionin, L-tyrosin, Glycine

8.    Zat Pengatur Tumbuh : ZPT sangat diperlukan sbg komponen medium. Tanpa ZPT pertumbuhan eksplan sangat lambat atau sama sekali tidak tumbuh

9.    Dua golongan ZPT yang sangat penting dalam kultur in vitro adalah : Auksin dan Sitokinin

Ø  Zat Pengatur Tumbuh

1.    Auksin yang sering digunakan adalah : 2,4-D, IAA, NAA, dan IBA

2.    2,4-D paling efektif utk menginduksi pembelahan sel dan pembentukan kalus

3.    NAA dan 2,4-D lebih stabil dibandingkan IAA, yaitu tidak mudah terurai oleh enzim-enzim yg dikeluarkan oleh sel atau karena pemanasan pada saat proses sterilisasi

4.    IAA : mudah rusak oleh cahaya dan oksidasi ensimatik

5.    Sitokinin : berperan dlm pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis

Sitokinin yang banyak dipakai adalah : Kinetin dan Benzylaminopurin (BAP)

6.    Kinetin dan auksin memberikan pengaruh interaksi terhadap diferensiasi jaringan.

7.    Giberellin : berperan dalam pembesaran dan pembelahan sel, juga pada pembentukan akar. Penggunaan giberellin dpt meningkatkan jumlah auksin endogen. Giberellin dalam bentuk larutan mudah rusak dan kehilangan sifatnya sebagai zpt pada perlakuan temperatur tinggi

Ø  Larutan Stok

Garam-garam anorganik dan zat organik dapat dibuat dalam bentuk larutan stok yang kemudian disimpan di almari es.

Larutan stok adalah larutan dalam bentuk pekat (biasanya 100x konsentrasi). Larutan stok makro dibuat dalam kelompok-kelom-pok yang terdiri dari beberapa senyawa kimia, yang pada waktu penyampuran tidak menyebabkan adanya endapan.

Larutan stok lain adalah untuk : unsur hara mikro, hormon, vitamin, iron (besi), zat pengatur tumbuh. Pembuatan larutan stok ini untuk menghindari kesalahan penimbangan karena kebutuhan berat yang sangat kecil.

Yang perlu diperhatikan dalam pembuatan larutan stok :

1.    Larutan stok yang terlalu pekat akan mengalami pengendapan pada waktu disimpan, sehinga perlu dilakukan pemanasan dulu sebelum dipakai.

2.    Larutan stok yang terkontaminasi mikroorganisme tidak dapat digunakan lagi.

Ø  Substansi Organik Kompleks

Ekstrak substansi organik yang banyak ditambahkan pada media kultur in vitro adalah :

o   Ekstrak yeast

o   Ekstrak malt

o   Air kelapa muda

o   Endosperm jagung

o   Juice orange

o   Juice tomat

o   Ekstrak kalpri

o   Ekstrak pisang

Penggunaan substansi organik ini jangan terlalu tinggi karena dapat merugikan pertumbuhan sel. Harus dilakukan pengujian pendahuluan. Substansi organik komplek ini mempunyai kelemahan yaitu tidak konsisten kadarnya dan tidak diketahui pasti komposisinya.

Ø  pH Media

pH tertentu diperlukan untuk pertumbuhan jaringan tanaman agar tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH sitoplasma. pH medium kultur jaringan biasanya berkisar antara 4,8 – 5,6, dan perlu dipertahankan tidak berubah selama medium digunakan. Pengaturan pH bisa dilakukan menggunakan : NaOH atau KOH atau HCl pada waktu semua komponen sudah dicampur. Penggunaan Fe, KH₂PO₄ atau K₂HPO₄ dapat mempertahankan pH mediun stabil.

Ø  Bahan Pemadat

Bahan pemadat yang sering digunakan adalah agar-agar 7 – 10 gr/liter. Bahan pemadat lain (jarang digunakan) adalah gelrite yang lebih bening dibandingkan agar-agar. Penggunaannya lebih sedikit yaitu 2 gr/liter

Kelemahan penggunaan bahan pemadat :

1.    Hanya sebagian eksplant yang kontak dengan medium

2.    Terjadi gradient nutrisi yang tidak sama

3.    Mobilitas zat hara menjadi kurang baik dan sering terjadi akumulasi zat-zat toksik yang dikeluarkan oleh eksplant

Media Kultur jaringan

A.   Berdasarkan Bentuknya

Bentuk media ada tiga macam yang dapat dibedakan dari ada atau tidaknya bahan tambahan berupa bahan pemadat seperti agar-agar atau gelatin. Bentuk media tersebut yaitu:

1.   Media Padat

Media padat adalah media yang dipadatkan dengan menambahkan agar-agar sehingga eksplan tidak mudah berpindah tempat. Media padat memiliki kelebihan dan kekurangan. Kelebihan media padat yaitu perkembangan eksplan mudah diamati terutama yang berukuran kecil, tidak semua bagian eksplan terbenam dalam media sehingga memungkinkan sirkulasi udara eksplan dan jika terjadi kontaminasi, eksplan yang tidak terkontaminasi dapat diselamatkan.

Kekurangan media padat yaitu hanya bagian permukaan eksplan yang mengalami aerasi dengan baik, hubungan antara media dan eksplan terbatas yaitu hanya pada bagian yang tersentuh media, sehingga perkembangannya tidak seimbang.

2.  Media Semi Cair

Media semi cair adalah media cair yang ditambahkan bahan pemadat berupa agar jumlahnya setengah atau sepertiga dari jumlah bahan agar untuk media padat. Ada juga media semi cair tanpa menggunakan agar melainkan bahan lain berupa filter polyethylene atau kain yang mudah menyerap air, sehingga dapat mengantarkan zat hara dari media ke eksplan. Media ini jarang digunakan karena sulit dalam pengaturan letak eksplan dan mengamati perkembangannya.

3.  Media cair

Media cair adalah media yang tidak menggunakan agar-agar. Penggunaan media ini dibantu dengan menggunakan alat agitasi yang dinamakan shaker. Media ini digunakan untuk mengatasi kelemahan-kelemahan pada media padat. Agitasi bertujuan untuk menciptakan pertukaran gas dan supaya eksplan tidak tenggelam. Agitasi memungkinkan seluruh permukaan eksplan menerima suplai zat hara dari media semaksimal mungkin.

B.   Berdasarkan Komposisi/Susunannya

Berdasarkan komposisi media dibagi atas:

1.    Media alami/non sintetis merupakan media yang disusun dari bahan-bahan alami dimana komposisinya yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya seperti, kentang, tepung, daging, telur, ikan sayur, dsb. Contohnya: Tomato juice agar.

2.    Media semi sintesis merupakan media yang disusun dari bahan-bahan alami dan bahan- bahan sintesis. Contohnya: Kaldu nutrisi disusun dari: Pepton 10,0 g, Ekstrak daging 10,0 g, NaCl 5,0 g dan Aquades 1000 ml.

3.    Media sintesis, yaitu media yang disusun dari senyawa kimia yang jenis dan takarannya diketahui secara pasti. Contohnya: Mac Conkey Agar.

Menurut George dan Sherington (1984) ada media dasar yang pada umumnya diberi nama sesuai dengan nama penemunya, antara lain:

1.     Medium dasar Murashige dan Skoog (MS), digunakan hamper pada semua macam tanaman terutama herbaceous. Media ini memiliki konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+.

2.   Medium dasar B5 atau Gamborg, digunakan untuk kultur suspense sel kedelai, alfafa dan legume lain.

3.   Medium dasar white, digunakan untuk kultur akar. Medium ini merupakan medium dasar dengan konsentrasi garam-garam mineral yang rendah.

4.     Medium Vacint Went (VW), digunakan khusus untuk medium anggrek.

5.     Medium dasar Nitsch dan Nitsch, digunakn untuk kultur tepung sari (Pollen) dan kultur sel.

6.     Medium dasar schenk dan Hildebrandt, digunakan untuk tanaman yang berkayu.

7.  Medium dasar Woody Plant Medium (WMP), digunakan untuk tanamn yang berkayu.

8.    Medium dasar N6, digunakan untuk tanaman serealia terutama padi, dan lain-lain.

Sumber:
http://infotani.net/teknik-kultur-jaringan-tanaman-bag-1/
http://tatik-widiyana.blogspot.com/2013/04/media-kultur-jaringan.html